168体育官方网站高通量自动化成像及分析设备使用心得——中科院分子细胞科学卓越创新中心高级工程师韩帅

　　随着自动化技术与显微成像技术的融合，以及图像分析技术的提升，涌现出了一大类高通量自动化成像及分析仪器。本文将结合我们在技术服务过程中的体会，重点就如何选择合适的高通量自动化成像及分析仪器进行讨论。

　　为帮助广大实验室用户及时了解高内涵成像前沿技术、创新产品与解决方案，向用户传递准确、实用的技术干货和宝贵的实验经验，仪器信息别组织策划

　　“高内涵成像技术”主题约稿活动(点击查看)。本期，特别邀请到中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学平台技术主管韩帅博士谈一谈高通量自动化成像及分析设备方面的使用心得。

　　转录组测序文库构建等技术体系搭建，为药物新靶标发现等高通量筛选项目提供技术咨询和服务。建立了多种基于高内涵的高通量筛选体系，作为主编组织编写了《高通量筛选技术实验手册》及《高内涵成像与分析实验手册》；利用自动化设备建立了基于384孔板模式的单细胞转录组自动化建库体系。所建立的技术体系帮助用户在Nature、Cell、Cancer Cell、Nature Genetics等知名期刊发表多篇研究论文。俗话说：“眼见为实”，显微成像技术是生命科学研究领域中至关重要的检测手段之一。随着自动化技术与显微成像技术的融合，以及图像分析技术的提升，涌现出了一大类高通量自动化成像及分析仪器。这类仪器不仅可以帮助我们在短时间内迅速获取大量图片，而且能够从中提取出多种参数的定量信息。这些特点使其能够最大程度上避免传统高通量筛选检测方式因检测指标相对单一而带来的假阳性和假阴性结果。目前168体育官方网站，高通量自动化成像及分析设备在高通量药物筛选、功能基因组筛选及其他多样品检测项目中有了越来越广泛的应用，涉及的领域也涵盖了细胞信号通路、肿瘤、神经生物学、免疫学、传染病学、干细胞等多种生物学研究领域。

　　是一个以高通量实验技术为手段，为功能基因组筛选及药物筛选等通量化实验提供服务的技术平台。显微成像是我们开展高通量筛选项目的重要检测手段之一。为了最大程度满足中心乃至全国用户在高通量成像及定量分析方面多元化的实验需求，平台目前配备了5台侧重点不同、各有优势的高通量自动化成像及分析设备。

　　为了帮助用户获得最佳数据168体育官方网站，我们对成像实验主要从以下三个方面进行综合考虑：

　　实验标记体系选择、成像设备选择及图像分析方法设置。其中实验标记体系及图像分析方法设置在《高内涵成像及分析实验手册》中有详细描述，本文将结合我们在技术服务过程中的体会，重点就如何选择合适的高通量自动化成像及分析仪器进行讨论。我们参考平台现有的设备，将自动化成像分析仪按照性能特点大致分为三个类别168体育官方网站，下文将分类探讨其特点及应用。

　　高内涵成像分析系统通常具备高分辨率、多通道成像、大样本容量和高通量的能力，配合强大的图像定量分析软件，适用于高度复杂的细胞和生物分子研究，如细胞表型分析、药物筛选等。具体来说，高分辨率的成像能力使研究者能够在微观水平上观察细胞和亚细胞结构的微观细节；其次，多通道成像使得研究者可以同时获得多个生物标记物的信息，为复杂生物学研究提供更全面的数据；高通量性能使得在相对短的时间内处理大量样本成为可能，支持高效的大规模实验和筛选。

　　高内涵成像分析仪配备非常强大的图像分析软件，这是它区分于其他类别高通量成像分析仪的最主要方面。其软件可以自动识别、分割细胞及细胞亚结构，并在此基础上对数目、形态、强度、定位、运动轨迹、纹理等多种参数进行定量化分析。大多分析软件的界面呈现为可自由组合的多种分析模块，用户可以像使用命令语句编写程序一样，根据实际需求非常灵活地将模块按照特定逻辑进行个性化组装，最终获得所需参数。分析软件还可以提供单个细胞的数据，并可根据单细胞数据对整体细胞进行亚群分类，非常适合异质性培养体系的分析。对于动力学实验，分析过程中配合细胞追踪模块（cell tracking）可以拿到每个单细胞的动力学变化数据。很多高内涵的分析软件中还加入了机器自学习或人工智能，对于复杂的表型或高通量筛选过程中会出现的不可预测的多样化表型进行智能化分析。这种智能化的图像分析有助于从庞大的图像数据中提取有意义的信息，加速实验结果的分析和解释。

　　根据光路设计的不同，高内涵又分为共聚焦高内涵及宽场高内涵两大类。共聚焦成像模式最大的优势在于去除了来自非焦面的信号，从而极大地提高图像的信噪比，使图像更清晰。但这并不意味着宽场成像在所有应用中都劣于共聚焦成像。在我们的实际运行过程中，宽场成像可以满足大部分日常需求，例如荧光强度、细胞形态、细胞迁移、周期、类器官大小和数目检测等等。在某些对信噪比要求较高的实验中，共聚焦表现出更大的优势。例如，对比较厚的样品（如类器官或多层生长的细胞）进行成像并需要对单个细胞进行精确定量时，共聚焦成像会去除大量来自非焦面的信号，从而给出更准确的数据；当关注的细胞亚结构尺寸较小（例如自噬小体、蛋白聚集体等呈现为点状的结构）时，共聚焦成像会获得信噪比更高的图像，使计数或荧光强度的分析更加准确；另外，对于信号较弱的样品，由于共聚焦成像一般使用能量强波长单一的激光作为激发光源，且通过pinhole过滤掉大部分来自培养基及板底的背景信号，图像信噪比会较宽场成像有非常显著地提升。高内涵成像分析仪在生命科学研究中的应用非常广泛。在细胞生物学中，它们被用于研究细胞形态学、细胞内信号传导、亚细胞结构等方面。在药物筛选和药物发现中，高内涵成像分析仪可以用于评估化合物对细胞的影响，加速新药物的发现和开发过程。此外，这些设备还在生物标记物研究、基因表达分析、蛋白质相互作用研究等方面发挥着关键作用。

　　相比于分析功能丰富而灵活但操作门槛较高的高内涵成像分析仪，另外一类仪器应用场景明确且操作简单更易上手。这类仪器在成像方面具有高度自动化的功能，成像速度快，能够拍摄高质量的明场及荧光图像；用户友好的操作界面使得操作者能够轻松设置实验参数、调整显微镜设置，并进行图像采集；但物镜配置往往以低倍镜为主，这些特点决定了这类成像仪器的应用场景基本以细胞整体水平的观测和分析为主，不适用于对分辨率要求更高的细胞亚结构水平的检测；分析软件提供的分析功能相对简单而明确，界面大多以已开发好的分析流程呈现给用户，用户只需优化部分参数的设置即可。

　　结合我们平台的实际运行情况，这类仪器较多的应用是细胞计数、细胞活死分析、病毒感染/质粒转染效率分析、细胞融合度分析/生长曲线绘制、基因表达/细胞整体荧光强度分析、克隆个数分析等。

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　　由于这类仪器低倍镜成像速度快，在以酶标仪读值作为主要检测指标的高通量筛选体系中，我们会根据具体情况建议用户在实验结束之前利用自动化显微镜收集全孔图像，便于后续酶标数据分析过程中对阳性孔或数据异常的孔回溯图像，从而帮助筛选者有效减少传统高通量筛选体系中的假阳性和假阴性。例如，实验结束前，在不影响酶标检测体系的前提下，利用核染色或明场成像统计孔内细胞数，可辅助校正由孔间细胞数差异导致的酶标读值变化。总之，这类仪器虽然功能相对简单，但它们提供了快速而有效的图像获取及简便的定量分析解决方案。

　　若要对活细胞样品进行较长时间的跟踪拍摄，通常需要在拍摄过程中提供二氧化碳、温度及湿度控制。虽然大多数自动化成像仪器能够实现二氧化碳和温度的控制，然而对于需要长时间跟踪拍摄的实验，如细胞生长曲线监测和细胞迁移监测往往需要持续数天，湿度控制对于确保在观察期间细胞处于最适宜状态变得尤为关键。这种情况下，就需要使用自动化活细胞长时程监测设备。

　　自动化活细胞监测设备的湿度控制有多种实现方式。一种是体积较小可直接放入细胞培养箱内使用的活细胞工作站，细胞培养箱为成像设备内的样品提供所有环境控制。这类仪器通常具备多个板位，能够实现对中等通量样本的同时监测。另一种方式是成像设备自身搭载自动湿度控制模块。另外，对于开放式的自动化显微镜，可通过在载物台上加装具有活细胞环境控制模块的腔室（chamber），来实现在拍摄过程中对活细胞环境的控制。然而，这类设备一次只能实现一块板的连续拍摄，更适用于低通量样本监测。此外，我们平台还采用了将高内涵成像设备通过机械臂与自动化培养箱整合的方式，实现活细胞长时程监测。当一块样品板完成拍摄后，机械臂将其送回自动化培养箱，继续下一块样品板的拍摄。这种运行方式也可实现中等通量的样品监测，但只适合拍照时间点间隔较长的实验。

　　在某些研究项目中，还会出现对氧气浓度有要求的实验（例如研究低氧或高氧环境对细胞的影响）。这种情况对环境控制提出了更高的要求，需要成像设备或培养箱搭载氧气浓度控制模块。

　　自动化活细胞长时程监测设备通过连续、实时的图像采集，使研究人员能够观察和记录细胞的实时变化。对于研究细胞的实时响应、细胞迁移、细胞周期、细胞增殖等过程至关重要，确保我们不会错过微观层面上的关键事件。综上所述，高通量自动化成像分析设备的不同类别在生命科学研究中各具特色，为科学家提供了多样化的工具，促进了研究的深入发展。高内涵成像分析仪通过高分辨率成像及丰富多样化的定量分析指标为生物学研究提供了深刻的洞察；分析功能相对简单而明确的自动化显微镜为分辨率要求不高的通量化检测提供了快速有效的图像获取及简便的定量分析解决方案；而活细胞长时程监测设备则使得细胞动态过程的观察更为全面和细致。这三类设备相互补充，共同推动了生命科学领域的进步，为科学家提供了更广阔的研究空间。在未来，随着这些设备技术的不断创新和进步，会更好地服务于生命科学研究。